TOPO Cloning Protocols

TOPO klónozó egy olyan folyamat , amely hasznosítja a klónozás , általában , 3 ' A maradékok , amelyek termodinamikailag instabilak, és egyesíti őket egy Taq DNS- polimeráz . Ezen túlmenően , a folyamatot használ egy friss termék polimeráz láncreakció ( PCR) kell tárolni , hogy a 4 Celsius fok. Ez a forma a klónozás optimalizálja az aktív topoizomeráz I molekulát adunk a végén egy lineáris vektor. Elvégzésére TOPO klónozás , egy bizonyos protokollt kell követni . Előkészítés : Matton

Néhány alapvető lépéseket lehet tenni , hogy felgyorsítsa a teljes TOPO klónozó folyamatot, és segít a sikeres működés érdekében . Először is, a csövek életképes sejtek kell jégre , hogy fenntartsák a elfogadhatóságát . Ezután a szuper optimális kultúra ( SOC ) közepes , a bakteriális növekedés dúsított tápanyagok, kell hozni szobahőmérsékletre. A szelektív lemezeket ezután előre felmelegedett 37 Celsius fok , így azok teljes mértékben készen áll, ha eljön az ideje, hogy használja őket.
Egyesítése Hozzávalók : Matton

Először a klónozás folyamat kombinációja 2 mikroliter polimeráz láncreakció ( PCR) termék , 0,5 mikroliter sóoldatban , és 0,5 mikroliter klónozó vektort kell kombinálni egy 0,5 milliliteres centrifugacsőbe. Amint egyesítjük, ezeket az összetevőket meg kell állítani , és szobahőmérsékleten hagytuk inkubálódni 09:55 percig. Ezután az egyesített összetevők hozzáadódik "Top -10 kémiailag kompetens sejtek" egy 50 mikroliteres csövet jégre tesszük , és további tíz percig. Ezt követően , a sejteket kell hősokkoltuk át 42 Celsius-fok , pontosan és jégre tesszük egy további perc előtt 180 mikroliter A SOC táptalajt adunk hozzá. Ezt a keveréket ezután kell rázni vízszintes irányban 200 rpm további egy órán át 37 Celsius fok.
Final Steps : Matton

A keveréket 50 pl és 100 mikroliter minden reakció kell aranyozott out " -ra LB + AMP + X - Gal lemezek és inkubáljuk rázás nélkül egy éjszakán át 37 ° C " A következő napon a három fehér telepeket minden egyes reakciót kell kiszemelt és elhelyezni 4 ml LB + és egy éjszakán át hagytuk inkubálódni hőmérsékleten 37 Celsius fok , miközben rázattuk 200 rpm-en. Az utolsó lépés a mini - készítmény a plazmidok és várja, hogy vajon a folyamat sikeres volt .